产品介绍

Plurioid^TM hPSC血管类器官试剂盒是一款基于人多能干细胞的专用培养系统，通过精准调控血管发育相关信号通路，可在体外高效构建功能完整的三维血管类器官。试剂盒采用优化无血清配方，仅需23天即可将hPSC定向分化，形成包含CD31+内皮细胞、α-SMA+平滑肌细胞、PDGFRβ+周细胞等多种关键血管细胞的类器官结构，并自发组装出具备生理活性的管腔组织。其细胞构成、组织结构及屏障功能均高度模拟天然血管，可为血管发育机制研究、血管相关疾病模型构建、抗血管药物筛选与药物安全性评价，提供稳定可靠、高仿真的体外三维研究模型。

本试剂盒规格为1 miniKit，预计可生成60个成熟血管类器官，并维持培养10天。该试剂盒使用需要操作人员具有hPSC培养经验，并对类器官具有一定了解。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Embryoid Body Induction formation Medium	HiBVO-K100	8 mL	4℃，6个月
Supplement A (5×)	HiBVO-K100	1 mL×2	-20℃，12个月
Mesoderm Induction Medium	HiBVO-K100	10 mL	4℃，6个月
Supplement B (25×)	HiBVO-K100	400 μL	-20℃，12个月
Vascular Lineage Induction Medium	HiBVO-K100	10 mL	4℃，6个月
Supplement C (25×)	HiBVO-K100	400 μL	-20℃，12个月
Vascular Differentiation Medium	HiBVO-K100	20 mL	4℃，6个月
Supplement D (25×)	HiBVO-K100	800 μL	-20℃，12个月
Vascular Angiogenesis Matrix Preparation Medium	HiBVO-K100	1 mL×2	4℃，6个月
Vascular Angiogenesis Matrix I	HiBVO-K100	750 μL×2	4℃，6个月
Vascular Angiogenesis Matrix II	HiBVO-K100	1 mL	-20℃，6个月
Blood Vessel Organoid Maturity Medium	HiBVO-K100	50 mL	4℃，6个月
Supplement E (25×)	HiBVO-K100	1 mL×2	-20℃，12个月

hPSC血管类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备hPSC血管类器官完全培养基。以下是准备将PSC诱导为血管类器官的拟胚体形成完全培养基、中胚层诱导完全培养基，血管谱系诱导完全培养基，血管分化完全培养基，血管类器官成熟完全培养基以及血管新生基质的制备示例，如所需量不同，请根据比例进行用量调整。

1. 冰上解冻Supplement A (5×)，Supplement B (25×)，Supplement C (25×)，Supplement D (25×)，Supplement E (25×)。

注意：解冻后，建议将Supplement A (5×)，Supplement B (25×)，Supplement C (25×)，Supplement D (25×)，Supplement E (25×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于微量试剂组分建议瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖使用，以避免损失。

2. 将400 μL Supplement A (5×)加至1.6 mL Embryoid Body Induction formation Medium中，充分混合，配制成2 mL拟胚体形成完全培养基。

3. 将80 μL Supplement B (25×)加至1.92 mL Mesoderm Induction Medium中，充分混合，配制成2 mL中胚层诱导完全培养基。

4. 将160 μL Supplement C (25×)加至3.84 mL Vascular Lineage Induction Medium中，充分混合，配制成4 mL血管谱系诱导完全培养基。

5. 将80 μL Supplement D (25×)加至1.92 mL Vascular Differentiation Medium中，充分混合，配制成2 mL血管分化完全培养基。

6. 将400 μL Supplement E (25×)加至9.6 mL Blood Vessel Organoid Maturity Medium中，充分混合，配制成10 mL血管类器官成熟完全培养基。

注意：配制好的培养基可在2-8 °C储存不超过3天，建议现配现用。Embryoid Body Induction formation Medium，Mesoderm Induction Medium，Vascular Lineage Induction Medium，Vascular Differentiation Medium，以及Blood Vessel Organoid Maturity Medium内均含有细菌及真菌抗生素。

7. 血管新生基质配制，以4 mL用量为例：

（1）配制pH为7.4的血管新生专用胶混合溶液：将1.5 mL Vascular Angiogenesis Matrix I与1.5 mL Vascular Angiogenesis Matrix Preparation Medium混合，制备成3 mL血管新生专用胶混合溶液，快速用pH指示条测量混合溶液的pH值，pH值应为~7.4。如不符合pH值要求，使用NAOH（1M）和HCl（1M）进行调节。

（2）配制血管新生基质：将3 mL血管新生专用胶混合溶液与1 mL Vascular Angiogenesis Matrix II充分混匀，配制成血管新生基质。

注意：此操作均需在冰上操作。

hPSC血管类器官的诱导培养

提前复苏 hPSC，传代两代以后，即可使用不同阶段的分化培养基依次进行诱导培养，具体步骤如下：

1、拟胚体形成（耗时1-3天）

Day 0-3：

（1）当 hPSC 的汇合度达到 75%-85%，吸去培养基，用 2 mL DPBS室温清洗一次。

（2）吸去上清，加入 0.5 mL 预热至室温的hPSC传代消化液，转移到 37 ℃ 5% CO₂ 细胞培养箱中孵育1-2 min。

注意：待克隆边缘细胞出现收缩即可终止消化。

（3）吸去上清，加入等体积的hPSC完全培养基，并使用 P1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，经台盼蓝染色确定细胞活性并计数。

注意：台盼蓝染色活细胞比例在90%以上。

（4）将单细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

（5）配制拟胚体形成完全培养基。

（6）离心结束，充分去除上清，使用预热的拟胚体形成完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至1×10⁵个/mL，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

（7）将细胞按照2×10⁵个/孔接种至低吸附6孔板内，即加入2 mL细胞悬液进行悬浮培养。每日半量换液。

注意：一般1-3天可形成球状拟胚体。待球体结构紧密，直径达到50-100 μm进入下一步骤。

2、中胚层诱导（耗时3天左右）

Day 4-6：

（1）配制中胚层诱导完全培养基。

（2）用剪去尖端的1 mL枪头，将球状拟胚体吸入5 mL离心管内，待自然沉降后，吸除上清。

（3）继续加入2 mL中胚层诱导完全培养基重悬球体，并重新接种至6孔板内，继续培养3天左右。

注意：若有球体黏连，使用剪去尖端的1 mL轻轻吹散以防止类器官融合，或轻微摇晃孔板使类器官分布均匀。

3、血管谱系诱导（耗时3天）

Day 7-9：

（1）配制血管谱系诱导完全培养基。

（2）用剪去尖端的1 mL枪头，将球体吸入5 mL离心管内，待自然沉降后，吸除上清。

（3）继续加入2 mL血管谱系诱导完全培养基重悬球体，并重新接种至原先的6孔板内。每隔2天更换一次培养基。此阶段血管球体逐渐变大，当开始出现空泡时，进入下一步骤。

注意：如发生球体黏连，使用剪去尖端的1 mL枪头轻轻吹散。

4、血管新生（耗时7天左右）

Day 10-16：

（1）计算血管新生阶段需要使用血管新生基质体积：血管新生一般在12孔板内进行，每个孔需使用1 mL血管新生基质，可接种20-40个球体。根据以下公式来计算需要配制的血管新生基质体积：血管新生基质体积/mL = 1 mL × 血管谱系诱导阶段6孔板内球体总数/(20-40)。

注意：血管新生阶段每个孔中的球体密度很关键，过于密集的播种会导致血管网络过度融合，而过于稀疏导致血管网络形成效率低。

（2）配置单次实验所需的血管新生基质，冰上操作。

（3）12孔板中每孔加入500 μL血管新生基质进行包被处理，37 ℃孵育2 h使其固化。

（4）用剪去尖端的1 mL枪头，将球体吸入5 mL离心管内，待自然沉降后，吸去上清，继续加入3 mL Vascular Differentiation Medium重悬球体，待自然沉降后，吸去上清。

（6）每20-40个球体使用500 μL血管新生基质重悬，并按照500 μL/孔的浓度接种至预先包被好的12孔板。通过前后摇晃平板，使胶液平铺在孔板。待球体分布良好，慢慢地将平板移至培养箱，37 ℃孵育2 h使其固化。

（7）配置血管分化完全培养基，预热后按照1 mL/孔加入到12孔板内。加入后约1-3 d内出现新生血管。

（8）3 d后更换新鲜的血管分化完全培养基，之后每隔一天更换一次。待血管网络形成后，进行下一步实验。

5、血管类器官组装及成熟（耗时5天）

Day 17-21：

（1）配制血管类器官成熟完全培养基。

（2）使用高压灭菌的小镊子，轻轻将血管网络周围的胶分离，并将其挑入超低吸附96孔板的一个孔内（血管类器官被少量周围基质包裹一起悬浮培养），1个球体/孔。

（3）按200 μL/孔加入血管类器官成熟完全培养基，继续培养。每2天换一次培养基。约4-5天左右可见血管类器官呈圆形且出现完全包裹的形态。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human blood vessel organoids were prepared from hPSCs with Human PSC-Derived Blood Vessel Organoid Kit (HiBVO-K100，Plurioid^TM SHR Biotechnology, Wuxi, China) according to manufacturer instructions.

附录1 hPSC血管类器官构建流程图

图1 hPSC血管类器官构建流程图，比例尺：100 μm。

附录2 hPSC血管类器官鉴定图

图2 hPSC血管类器官免疫荧光染色鉴定。分别对成熟血管类器官进行免疫荧光染色。其中，Col IV用于标记血管基底膜、CD31用于标记血管内皮细胞，α-SMA用于标记血管平滑肌细胞。比例尺：20 μm（上）或50 μm（下）。

图3 透射电镜观察hPSC血管类器官。透射电镜观察hPSC血管类器官中的管腔结构，可见血管腔外周环绕着内皮细胞，并且出现紧密连接，外周存在结合的周细胞和平滑肌细胞。EC-内皮细胞；PER-周细胞；SMC-平滑肌细胞；Lumen-管腔；BM-基底膜；TJ-紧密连接。

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
hPSC完全培养基	SHR Biotechnology	HPCM-100
hPSC传代消化液	SHR Biotechnology	HPPD-100
hPSC培养专用基质胶	CORNING	354277
NAOH	-	-
HCl	-	-
DPBS	-	-