产品介绍

Plurioid^TM hPSC心脏类器官试剂盒是一款专为诱导人多能干细胞（hPSC）定向分化为功能性心脏类器官而开发的实验试剂。本试剂盒能够在体外快速构建包含心肌细胞、心脏成纤维细胞等多种功能性细胞组分的三维类器官模型。该模型可自发形成空腔结构并产生稳定节律性搏动，高度重现了天然心脏的关键生理特征，为心脏疾病机制研究、药物心脏毒性评估及心血管药物筛选等研究领域提供了高度仿真的实验平台。

本试剂盒规格为1 miniKit，预计可生成45个心脏类器官，需要操作人员具有hPSC培养经验，并对类器官具有一定了解。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Human PSC-Derived Cardiac Organoid Induction Medium	HiCAO-K160	8 mL	4℃，6个月
Supplement A (5×)	HiCAO-K160	1 mL×2	-20℃，12个月
Supplement B (100×)	HiCAO-K160	50 μL	-20℃，12个月
Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium	HiCAO-K160	150 mL	4℃，6个月
Supplement C (50×)	HiCAO-K160	550 μL	-20℃，12个月
Supplement D (50×)	HiCAO-K160	250 μL	-20℃，12个月
Supplement E (50×)	HiCAO-K160	150 μL	-20℃，12个月
Supplement F (50×)	HiCAO-K160	150 μL	-20℃，12个月
Supplement G (50×)	HiCAO-K160	1 mL×2	-20℃，12个月

hPSC心脏类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备hPSC心脏类器官完全培养基。以下是准备将hPSC诱导为心脏类器官的拟胚体诱导培养基a，心脏类器官诱导培养基b，以及心脏类器官分化培养基c，d，e，f，g的配制示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 按当前实际分化阶段（见产品信息表格所描述的各分化阶段），提前于2-8 °C解冻所需的分化培养添加物，不要过早解冻非当前分化阶段所需添加物。

注意：所有组分初次解冻后，建议分装后置于2-8°C按需保存取用，避免反复冻融。对于微量试剂组分建议解冻后瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖使用，以避免损失。

2. 将1 mL Supplement A (5×)和50 μL Supplement B (100×)加至3.95 mL Human PSC-Derived Cardiac Organoid Induction Medium中，充分混合，配制成5 mL拟胚体诱导培养基a。

3. 将1 mL Supplement A (5×)加至4 mL Human PSC-Derived Cardiac Organoid Induction Medium中，充分混合，配制成5 mL心脏类器官诱导培养基b。

4. 将200 μL Supplement C (50×)加至9.8 mL Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成10 mL心脏类器官分化基础培养基c。

5. 将100 μL Supplement D (50×)和100 μL类器官专用基质胶（OEM-10）加至4.8 mL Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成5 mL心脏类器官分化培养基d。

6. 将100 μL Supplement E (50×)加至4.9 mL Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成5 mL心脏类器官分化培养基e。

7. 将100 μL Supplement F (50×)加至4.9 mL Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成5 mL心脏类器官分化培养基f。

8. 将200 μL Supplement G (50×)加至9.8 mL Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成10 mL心脏类器官分化培养基g。

注意：配制好的各种培养基可在2-8°C储存不超过3天，建议现配现用。Human PSC-Derived Cardiac Organoid Induction Medium和Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium内含有细菌及真菌抗生素。

hPSC心脏类器官的诱导培养

提前复苏 hPSC，传代两代以后，即可使用各阶段培养基进行诱导培养，具体步骤如下：

1、拟胚体诱导（耗时2天）

Day -2：

（1）当 hPSC 的汇合度达到 75%-85%，吸去培养基，用 2 mL DPBS室温清洗一次。

（2）吸去上清，加入 0.5 mL 预热至室温的hPSC传代消化液，转移到 37 ℃ 5% CO₂ 细胞培养箱中孵育1-2 min。

（3）吸去上清，加入等体积的拟胚体诱导培养基a，并使用 P1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，经台盼蓝染色确定细胞活性并计数。

注意：待克隆边缘细胞出现收缩即可终止消化，台盼蓝染色活细胞比例建议在90%以上。

（4）300 g离心3 min收集细胞后，加入拟胚体诱导培养基a重悬细胞至浓度为1×10⁵个/mL，按100 μL/孔接种10000个细胞至96孔U底超低吸附板。在水平孔板离心机内300 g离心5 min后细胞聚集成球状。之后将孔板转移到37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育24 h。

注意：建议接种至孔板中心的45个孔，周围孔补加DPBS，以减少蒸发。一个孔生成一个类器官。

Day -1：

（6）吸去旧培养基，每孔加入100 μL心脏类器官诱导培养基b，在37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中继续孵育24 h。此时球体开始出现明显边界。

2、心脏中胚层分化（耗时6天）

Day 0：

（1）使用剪去尖端的黄色枪头将每个球体吸出至5 mL EP管中，自然沉降，加入DPBS，洗两遍。之后，使用Human PSC-Derived Cardiac Organoid Differentiation Medium清洗2遍，再使用心脏类器官分化培养基c清洗一遍，自然沉降后去除上清。

注意：清洗过后，球体周围碎细胞减少。

（2）于EP管中加入2-3 mL心脏类器官分化培养基d重悬球体。

（3）使用DPBS清洗第一阶段使用的96孔U底超低吸附培养板。

（4）用心脏类器官分化培养基d重悬球体再次接种至先前使用的96孔U底超低吸附培养板中，一个孔一个球体。每孔心脏类器官分化培养基d补加至250 μL。

注意：①将类器官只种在板子的中心孔，周围一圈补加200 μL PBS，以减少中心孔的培养基蒸发；②每次接触类器官以及培养基的枪头，都需要用类器官润洗液（OMR-100）润洗一遍，以减少枪头上的杂质带入类器官内生长。

Day 1：

（4）吸去166 μL培养基/孔，补加166 μL心脏类器官分化培养基c/孔。

Day 2：

（5）继续吸去166 μL培养基/孔，补加入166 μL心脏类器官分化培养基e。

注意：球体开始生长变大。

Day 4-6：

（6）继续吸去166 μL培养基/孔，补加入166 μL心脏类器官分化培养基c/孔。Day 6进行相同操作。

注意：球体内部出现逐渐变大的空腔。

3、心脏类器官分化及成熟

Day 7：

（1）配制心脏类器官分化培养基f和心脏类器官分化培养基g。

（2）吸去166 μL培养基/孔，补加入166 μL心脏类器官分化培养基f/孔。

（3）于细胞培养箱培养1 h后，继续吸去166 μL培养基/孔，补加入166 μL心脏类器官分化培养基g/孔。

Day 8-30：

（4）于Day 8吸去166 μL培养基/孔，补加入166 μL心脏类器官分化培养基g/孔。之后每2-3天如此操作，补加一次心脏类器官分化培养基g。

注意：球体结构更加紧密，约于Day 10-15天左右观察到跳动。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human Cardiac organoids were prepared from hPSCs with Human PSC-Derived Cardiac Organoid Kit（HiCAO-K150，Plurioid^TM SHR Biotechnology, Wuxi, China) according to manufacturer instructions.

附录1 hPSC心脏类器官构建流程

图1 hPSC心脏类器官构建流程图。

图2 hPSC心脏类器官免疫荧光染色鉴定。分别对成熟心脏类器官进行免疫荧光染色。其中，cTnT用于标记心肌细胞，α-SMA用于标记血管平滑肌细胞，WT1用于标记心外膜细胞，Vimentin用于标记心脏成纤维细胞。比例尺：50 μm。

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
hPSC完全培养基	SHR Biotechnology	HPCM-100
hPSC传代消化液	SHR Biotechnology	HPPD-100
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
类器官润洗液	SHR Biotechnology	OMR-100
hPSC培养专用基质胶	CORNING	354277
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