产品介绍

Plurioid^TM hPSC肝类器官试剂盒是一款用于将人多能干细胞定向诱导分化为肝类器官的专用试剂产品，可在体外培养体系中有效模拟肝脏微环境，重建肝脏及胆管微组织结构。经该试剂盒构建的肝类器官富含功能性肝细胞（ALB+）、胆管细胞（CK7+）及其他肝脏关键细胞类型，能够高度模拟肝脏生理结构与功能特征。该模型可为肝脏发育机制研究、各类肝脏功能障碍病理机制研究提供稳定可靠的体外研究工具，同时适用于药物肝毒性评价、候选药物筛选及安全性评估，为肝脏疾病基础研究与新药研发提供重要支撑。

本试剂盒规格为1 miniKit，预期可获得超过5000个成熟肝类器官，需要操作人员具有hPSC培养经验，并对类器官具有一定了解。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Human PSC-Derived Liver Organoid Differentiation Medium	HiLVO-K150	50 mL	4℃，6个月
Supplement A (50×)	HiLVO-K150	100 μL	-20℃，1年
Supplement B (50×)	HiLVO-K150	500 μL	-20℃，1年
Supplement C (25×)	HiLVO-K150	800 μL	-20℃，1年
Human PSC-Derived Liver Organoid Expansion Medium	HiLVO-K150	75 mL	4℃，6个月
Supplement D (25×)	HiLVO-K150	1 mL×2	-20℃，1年
Supplement E (25×)	HiLVO-K150	1 mL	-20℃，1年
Human PSC-Derived Liver Organoid Maturity Medium	HiLVO-K150	25 mL	4℃，6个月
Supplement F (25×)	HiLVO-K150	1 mL	-20℃，1年

hPSC肝类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备hPSC肝类器官完全培养基。以下是准备hPSC诱导为肝类器官的分化培养基、扩增培养基和成熟培养基的示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 冰上解冻Supplement A (50×)，Supplement B (50×)，Supplement C (25×)，Supplement D (25×)，Supplement E (25×)，Supplement F (25×)。

注意：解冻后，建议将Supplement A (50×)，Supplement B (50×)，Supplement C (25×)，Supplement D (25×)，Supplement E (25×)，Supplement F (25×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于微量试剂组分建议瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖使用，以避免损失。

2. 将40 μL Supplement A (50×)加至1.96 mL Human PSC-Derived Liver Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成2 mL人肝类器官分化培养基a。

3. 将200 μL Supplement B (50×)加至9.8 mL Human PSC-Derived Liver Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成10 mL人肝类器官分化培养基b。

4. 将320 μL Supplement C (25×)加至7.68 mL Human PSC-Derived Liver Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成8 mL人肝类器官分化培养基c。

5. 将400 μL Supplement D (25×)加至9.6 mL Human PSC-Derived Liver Organoid Expansion Medium中，充分混合，配制成10 mL人肝类器官扩增培养基d。

6. 将400 μL Supplement E (25×)加至9.6 mL Human PSC-Derived Liver Organoid Expansion Medium中，充分混合，配制成10 mL人肝类器官扩增培养基e。

7. 将400 μL Supplement F (25×)加至9.6 mL Human PSC-Derived Liver Organoid Maturity Medium中，充分混合，配制成10 mL人肝类器官成熟培养基。

注意：配制后的培养基可在2-8 °C储存不超过3天，建议现配现用。Human PSC-Derived Liver Organoid Differentiation Medium、Human PSC-Derived Liver Organoid Expansion Medium和Human PSC-Derived Liver Organoid Maturity Medium内含有细菌及真菌抗生素。

hPSC肝类器官的诱导培养

提前复苏 hPSC，传代两代以后，即可使用不同阶段的肝类器官分化培养基依次进行诱导培养，具体步骤如下：

1、hPSC分化为内胚层细胞（DE）

Day 0：

（1）配制人肝类器官分化培养基a。

（2）当提前培养的hPSC汇合度达到 60%-80%，吸去培养基，用 2 mL DPBS室温清洗一次。

（3）吸去DPBS，加入 2 mL 人肝类器官分化培养基a。

Day 1-4：

（1）配制人肝类器官分化培养基b。

（2）24 h后（第1天），吸去培养基，并加入 2 mL人肝类器官分化培养基b，每24 h更换一次培养基，连续培养5天。

2、DE诱导分化为肝内胚层（HE）

Day 5-8：

（1）从培养物中吸去旧培养基，并加入2 mL DPBS室温清洗培养物，然后从孔中移除DPBS。

（2）每孔加入 2 mL 人肝类器官分化培养基c，将培养板放入 37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养，每24 h更换一次培养基，连续培养4天。

3、HE诱导分化为3D肝祖类器官

Day 9-24：

（1）配制人肝类器官扩增培养基d。

（2）在冰上解冻类器官专用基质胶（OEM-10），并将移液器吸头提前置于-20 ℃冰箱中。

（3）从培养物中吸去旧培养基，并加入2 mL DPBS室温清洗培养物，然后从孔中移除DPBS。

（4）加入hPSC传代消化液（HPPD-100），在 37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育2 min。

注意：待克隆边缘细胞出现收缩即可终止消化。

（5）吸去hPSC传代消化液，每孔加入 1 mL 恢复室温的人肝类器官扩增培养基d终止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离孔底。取少部分细胞悬液使用台盼蓝染色确定细胞活性并计数。

注意：活细胞比例应在90%以上。

（6）将细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心3 min，吸去培养基。

（7）将细胞重悬于冷的类器官专用基质胶（OEM-10，>70% vol/vol）中，吹打混匀后以15000-20000个细胞/孔的密度包埋在25-30 μL基质胶中，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30 s以避免基质胶过早凝固。

注意：24孔板每孔推荐接种一个25-30 μL基质胶滴，可根据细胞计数结果确定需要接种的胶滴数量。混合过程中应尽量避免产生气泡，以免影响后续观察以及类器官生长。

（8）将基质胶与细胞混合悬液按每孔25-30 μL接种到24孔板的孔中心位置，避免悬液接触孔板侧壁。

（9）将铺好的培养板置于37 ℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15-25 min左右成胶。

（10）待基质胶完全凝固后，小心沿孔壁加入人肝类器官扩增培养基d，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。如形成的基质胶穹顶结构较高，可加入600 μL保证浸没完全。

（11）将24孔板放到37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养。每隔一天更换培养基，连续培养15天。

4、3D肝祖类器官扩增培养

Day 25：

（1）配制人肝类器官扩增培养基e。

（2）吸去旧培养基，并加入2 mL DPBS室温洗涤1次，然后从孔中移除DPBS。

（3）每孔加入 2 mL 人肝类器官扩增培养基e，将培养板放入 37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养，每隔一天更换培养基，连续培养3-5天。

注意：此阶段可获得肝祖类器官，可继续传代、分化，或冻存。

hPSC肝类器官的传代培养

（1）提前取出冷冻的类器官专用基质胶（OEM-10）置于4℃解冻过夜，并将枪头放置在-20 ℃预冷1 h后使用。

（2）吸除培养基，加入 1 mL 预冷的 DPBS 溶解待传代的含类器官基质胶滴，将混合液转移到 1.5 mL EP管中，300 g离心3 min，去除上层的 DPBS 和基质胶后，使用预冷的DPBS再次清洗去胶。

注意：建议使用水平转子离心机，更利于基质胶与类器官的分离。

（3）待类器官从基质胶中分离出来后，加入 0.2 mL 的类器官传代消化液（OPD-100），通过吹打混匀使类器官与传代消化液充分接触，接着转移到37℃培养箱中，静置解离2 min后轻微吹打，镜下观察到小细胞团即可终止消化。

（4）终止消化后，300 g离心3 min，去除上清，用预冷枪头加入适量的类器官专用基质胶（OEM-10，>70% vol/vol），混合均匀。混合过程中应尽量避免产生气泡，且重悬时间不超过30 s以避免基质胶过早凝固。

注意：传代比例建议为1:3-1:5，根据消化获得的细胞团数量选择。

（5）将基质胶与细胞混合悬液按每孔25-30 μL接种到24孔板的孔中心位置，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

（6）将铺好的培养板置于37 ℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15-25 min左右成胶。

（7）待基质胶完全凝固后，小心沿孔壁加入恢复室温的人肝类器官扩增培养基e，24孔板每孔500 μL。

注意：沿壁缓慢加入培养基，避免破坏已凝固结构。如基质胶穹顶结构较高，可加入600 μL保证浸没完全。

（8）将24孔板放到37 ℃、5% CO₂培养箱中，继续培养。每隔一天换液一次，7天左右传代一次。

hPSC肝类器官的成熟分化

选择传代后扩增培养第14天的肝类器官，加入人肝类器官成熟培养基进行成熟分化，步骤如下：

（1）配制人肝类器官成熟培养基。

（2）在避免破坏基质胶的情况下，小心从待分化孔中吸出所有培养基，然后加入500 μL已配制好的人肝类器官成熟培养基。

（3）每2-3天更换一次培养基，在分化培养基中持续培养至第10天即可完全分化为成熟肝类器官，并可收获用于免疫染色或功能分析等。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human liver organoids were prepared from hPSCs with Plurioid^TM Human PSC-Derived Liver Organoid Kit（HiLVO-K150，SHR Biotechnology, Wuxi, China) according to manufacturer instructions.

附录1 hPSC肝类器官构建流程

图1 hPSC肝类器官构建流程图。

图2 hPSC肝类器官的传代与复苏生长示意图。

图3 hPSC肝类器官HE染色鉴定。分别对扩增期（A）和成熟分化（B）的肝类器官进行HE染色观察病理结构。比例尺：50 μm。

图4 hPSC肝类器官免疫荧光染色鉴定。分别对扩增期（A）和成熟分化（B）的肝类器官进行免疫荧光染色。AFP：甲胎蛋白（肝祖细胞表达）；ALB：白蛋白（肝细胞表达）；EPCAM：上皮细胞标记；CK7：角蛋白7（胆管细胞表达）；SOX9：干细胞标记；CYP3A4：细胞色素 P450 酶（肝细胞表达）。

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
hPSC完全培养基	SHR Biotechnology	HPCM-100
hPSC传代消化液	SHR Biotechnology	HPPD-100
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
类器官传代消化液	SHR Biotechnology	OPD-100
hPSC培养专用基质胶	CORNING	354277
DPBS	-	-