产品介绍

Plurioid^TM hPSC中脑类器官试剂盒是一款专为诱导人多能干细胞（hPSC）定向分化为中脑类器官而开发的实验试剂。本试剂盒依托优化的分化体系与配方，可支持在体外稳定、高效地构建结构完整的中脑类器官，其细胞构成、组织形态及关键功能特性均与体内生理状态下的中脑高度近似。该模型能够真实模拟中脑微环境与神经元发育过程，为神经退行性疾病机制研究、疾病模型构建、多巴胺能神经元功能解析以及中枢神经系统药物筛选、药效评价与安全性评估，提供了高仿生、高稳定性的三维体外研究平台，适用于基础科研与药物研发等场景。

本试剂盒规格为1 miniKit，预计可生成50个中脑类器官，需要操作人员具有hPSC培养经验，并对类器官具有一定了解。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Human PSC-Derived Midbrain Organoid Differentiation Medium	HiMBO-K150	150 mL	4℃，6个月
Supplement A (50×)	HiMBO-K150	700 μL	-20℃，1年
Supplement B (100×)	HiMBO-K150	350 μL	-20℃，1年
Supplement C (50×)	HiMBO-K150	150 μL	-20℃，1年
Supplement D (50×)	HiMBO-K150	200 μL	-20℃，1年
Supplement E (100×)	HiMBO-K150	100 μL	-20℃，1年
Supplement F (50×)	HiMBO-K150	300 μL	-20℃，1年
Supplement G (100×)	HiMBO-K150	150 μL	-20℃，1年
Supplement H (50×)	HiMBO-K150	900 μL×2	-20℃，1年
Supplement I (100×)	HiMBO-K150	900 μL	-20℃，1年

hPSC中脑类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备hPSC中脑类器官完全培养基。以下是准备将hPSC诱导为中脑类器官的神经谱系诱导培养基a、神经谱系诱导培养基b、中脑类器官分化培养基a，中脑类器官分化培养基b，中脑类器官成熟培养基的示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 冰上解冻Supplement A (50×)，Supplement B (100×)，Supplement C (50×)，Supplement D (50×)，Supplement E (100×)，Supplement F (50×)，Supplement G (100×)，Supplement H (50×)，Supplement I (100×)。

注意：解冻后，建议将Supplement A (50×)，Supplement B (100×)，Supplement C (50×)，Supplement D (50×)，Supplement E (100×)，Supplement F (50×)，Supplement G (100×)，Supplement H (50×)，Supplement I (100×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于微量试剂组分建议离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖使用，以避免损失。

2. 将20 μL Supplement A (50×)、10 μL Supplement B (100×)和20 μL Supplement C (50×)加至950 μL Human PSC-Derived Midbrain Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成1 mL神经谱系诱导培养基a（仅第一天种96孔U底板时使用）。

3. 将200 μL Supplement A (50×)和100 μL Supplement B (100×)加至9.7 mL Human PSC-Derived Midbrain Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成10 mL神经谱系诱导培养基b。

4. 将200 μL Supplement D (50×)和100 μL Supplement E (100×)加至9.7 mL Human PSC-Derived Midbrain Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成10 mL中脑类器官分化培养基a。

5. 将200 μL Supplement F (50×)、100 μL Supplement G (100×)和500 μL类器官专用基质胶（5%体积比）加至9.2 mL Human PSC-Derived Midbrain Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成10 mL中脑类器官分化培养基b。

6. 将200 μL Supplement H (50×)、100 μL Supplement I (100×)和100 μL类器官专用基质胶（1%体积比）加至9.6 mL Human PSC-Derived Midbrain Organoid Differentiation Medium中，充分混合，配制成10 mL中脑类器官成熟培养基。

注意：配制好的各阶段培养基可在2-8 °C储存不超过3天，建议现配现用。Human PSC-Derived Midbrain Organoid Differentiation Medium内含有细菌及真菌抗生素。

hPSC中脑类器官的诱导培养

提前复苏 hPSC，传代两代以后，即可使用各种分化培养基依次进行诱导培养，具体步骤如下：

神经谱系诱导

Day 1：

（1）当 hPSC 的汇合度达到 75%-85%，吸去培养基，用 2 mL DPBS室温清洗一次。

（2）吸去上清，加入 0.5 mL 预热至室温的hPSC传代消化液，转移到 37 ℃ 5% CO₂ 细胞培养箱中孵育1-2 min。

注意：待克隆边缘细胞出现收缩即可终止消化。

（3）吸去上清，加入等体积的 hPSC 完全培养基，并使用 P1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，经台盼蓝染色确定细胞活性并计数。

注意：台盼蓝染色活细胞比例在90%以上。

（4）将单细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

（5）配制神经谱系诱导培养基a、b。

（6）离心结束，充分去除上清，使用神经谱系诱导培养基a重悬细胞，稀释至1×10⁵个/mL，按照10000个细胞/孔接种到96孔U底超低吸附板内，每孔加入100 μL。

（7）在水平孔板离心机内300 g离心5 min，然后将孔板转移到37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育24 h。

注意：建议接种至孔板中心的50个孔中，并在周围孔中补加DPBS，以减少培养基蒸发。每个孔内接种细胞可发育为一个中脑类器官。

Day 2-8：

（8）第2天，将培养基换为神经谱系诱导培养基b，按每孔100 μL的体积加入孔中。之后每天换液持续培养至第9天。

中脑类器官分化

Day 9-10：

（1）第9天，配制中脑类器官分化培养基a。

（2）将神经谱系诱导培养基b更换为中脑类器官分化培养基a，按每孔100 μL的体积加入孔中，并将培养板继续放入37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养48 h，每天更换一次培养基。

Day 11-13：

（3）第11天，配制中脑类器官分化培养基b。

（4）将中脑类器官分化培养基a更换为中脑类器官分化培养基b，按每孔100 μL的体积加入孔中。将培养板继续放入37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养72 h，每天更换一次培养基。

中脑类器官成熟

Day 14-45：

（1）第14天，配制中脑类器官成熟培养基。

（2）使用剪去针尖的P1000枪头，将培养的中脑类器官吸出放入超低吸附6孔板内，一般一个孔内放15-20个类器官。

（3）加入2 mL中脑类器官成熟培养基，每2-3天更换一次，持续培养至第45天或更久，即可获得成熟中脑类器官。

注意：此阶段采用摇床培养有助于提升类器官的活性，建议80转/分钟。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human midbrain organoids were prepared from hPSCs with Plurioid^TM Human PSC-Derived Midbrain Organoid Kit（HiMBO-K150，SHR Biotechnology, Wuxi, China) according to manufacturer instructions.

附录1 hPSC中脑类器官构建流程

图1 hPSC中脑类器官构建流程图。比例尺：100 μm。

图2 hPSC中脑类器官免疫荧光染色鉴定。分别对D8、D35的中脑类器官进行免疫荧光染色。Ki67：增殖活性标志物；Neun、Tuj1：泛神经元标志物；TH：多巴胺能神经元标志物。比例尺：100 μm。

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
hPSC完全培养基	SHR Biotechnology	HPCM-100
hPSC传代消化液	SHR Biotechnology	HPPD-100
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
hPSC培养专用基质胶	CORNING	354277
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