产品介绍

Plurioid^TM hPSC全脑类器官试剂盒是一款专为诱导人诱导多能干细胞（hPSC）定向分化为全脑类器官而开发的实验试剂，可高效生成高度仿生的三维全脑类器官。成熟的全脑类器官包含端脑、间脑、中脑等关键脑区结构，并富集多巴胺能神经元、谷氨酸能神经元、星形胶质细胞等多种中枢神经细胞，其细胞组成、空间架构与电生理功能高度复刻体内人脑特征，为阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病建模、中枢神经药物筛选与毒性评价、脑发育机制研究提供了可靠的体外研究平台。

本试剂盒规格为1 miniKit，预计可生成50个全脑类器官，需要操作人员具有hPSC培养经验，并对类器官具有一定了解。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Embryoid Body Induction formation Medium	HiWBO-K100	25 mL	4℃，6个月
Supplement A (5×)	HiWBO-K100	3 mL	-20℃，1年
Supplement B (5×)	HiWBO-K100	2 mL	-20℃，1年
Human PSC-Derived Neural lineage Induction Medium	HiWBO-K100	15 mL	4℃，6个月
Supplement C (100×)	HiWBO-K100	150 μL	-20℃，1年
Human PSC-Derived Whole Brain organoid differentiation culture Medium	HiWBO-K100	60 mL	4℃，6个月
Supplement D (50×)	HiWBO-K100	300 μL	-20℃，1年
Supplement E (50×)	HiWBO-K100	900 μL	-20℃，1年

hPSC全脑类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备hPSC全脑类器官完全培养基。以下是准备将hPSC诱导为全脑类器官的各种培养基的示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 冰上解冻Supplement A (5×)，Supplement B (5×)，Supplement C (100×)，Supplement D (50×)，Supplement E (50×)。

注意：初次解冻后，建议将Supplement A (5×)，Supplement B (5×)，Supplement C (100×)，Supplement D (50×)，Supplement E (50×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于所有微量试剂组分建议解冻后瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm），再开盖使用，以避免损失。

2. 将1 mL Supplement A (5×)加至4 mL Embryoid Body Induction formation Medium中，充分混合，配制成5 mL拟胚体诱导完全培养基a。

3. 将1 mL Supplement B (5×)加至4 mL Embryoid Body Induction formation Medium中，充分混合，配制成5 mL拟胚体诱导完全培养基b。

4. 将50 μL Supplement C (100×)加至4.95 mL Human PSC-Derived Neural lineage Induction Medium中，充分混合，配制成5 mL神经诱导完全培养基c。

5. 将100 μL Supplement D (50×)加至4.9 mL Human PSC-Derived Whole Brain organoid differentiation culture Medium中，充分混合，配制成5 mL全脑类器官分化完全培养基d。

6. 将100 μL Supplement E (50×)加至4.9 mL Human PSC-Derived Whole Brain organoid differentiation culture Medium中，充分混合，配制成5 mL全脑类器官分化完全培养基e。

注意：配制好的培养基可在2-8 °C储存不超过3天，建议现配现用。Embryoid Body Induction formation Medium、Human PSC-Derived Neural lineage Induction Medium和Human PSC-Derived Whole Brain organoid differentiation culture Medium内含有细菌及真菌抗生素。

hPSC全脑类器官的诱导培养

提前复苏 hPSC，传代两代以后，即可使用各阶段培养基进行诱导培养，具体步骤如下：

拟胚体（EB）形成

Day 0-3：

（1）当 hPSC 的汇合度达到 60%-80%时，吸去培养基，用 2 mL DPBS室温清洗一次。

（2）吸去上清，加入 0.5 mL 的已放置室温的hPSC传代消化液，转移到 37 ℃ 5% CO₂ 细胞培养箱中 1-2 min。

（3）吸去上清，加入等体积的hPSC完全培养基，并使用 P1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，经台盼蓝染色确定细胞活性并计数。

注意：待克隆边缘细胞出现收缩即可终止消化，台盼蓝染色活细胞比例建议在90%以上。

（4）将单细胞悬液收集到15 mL离心管中，室温下300 g离心5 min。

（5）配制拟胚体诱导完全培养基a。

（6）离心结束，充分去除上清，使用拟胚体诱导完全培养基a重悬细胞，调整至最终浓度为5,000个活细胞/100 μL，按照5000个细胞/孔接种到96孔U底超低吸附板内，每孔加入100 μL。

（7）在水平孔板离心机内300 g离心5 min，然后将孔板转移到37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养3天，每日半量换液拟胚体诱导完全培养基a。

注意：每个孔内接种细胞可发育为一个脑类器官。建议接种至孔板中心的孔中，并在周围孔中补加DPBS，以减少培养基蒸发。

Day 4-6：

（8）配制拟胚体诱导完全培养基b。

（9）第4天，全部更换为拟胚体诱导完全培养基b，继续每日半量换液，培养至第6天，此阶段EB继续生长至350-600 μm。

原始神经上皮诱导

Day 6-10：

（1）配制神经诱导完全培养基c。

（2）第6天，使用剪去尖端的枪头（枪头用润洗液润洗）将每个 EB 轻柔转移至超低吸附六孔板的一个孔中（25个EB/孔）。每孔加入2 mL神经诱导完全培养基c。

（3）分别于第8天和第10天，半量换液新鲜的神经诱导完全培养基c。

将类器官包埋入类器官专用基质胶液滴中（D11）

Day 11：

（1）制备带凹坑的 Parafilm 基底

a. 使用保存在洁净环境中的 Parafilm。操作前，用70% 乙醇喷洒手套和 Parafilm 表面进行消毒。

b. 戴手套后，将Parafilm 覆盖在空的 200 μL 吸头盒上（图1A）。

c. 用手指在每个吸头孔正上方的 Parafilm 上轻轻按压，形成小凹坑，用于承载类器官专用基质胶液滴（图1A-B）。

d. 在 Parafilm 上制作一个 4×4 的凹坑阵列（共16个）。用无菌剪刀将该区域裁剪成一个小方块，放入一个 60 mm 组织培养皿中（图1C-D）。

（2）转移类器官至凹坑

a. 使用剪口的 200 μL 吸头，将类器官逐个转移至 Parafilm 上的每个凹坑中。

b. 吸除多余培养基。用未剪口的标准 200 μL 吸头，小心吸走每个类器官周围的多余液体。吸液时，避免将球体吸入吸头造成损伤。

（3）加入类器官专用基质胶液滴

立即向每个类器官滴加约 30 μL 类器官专用基质胶，使其充满整个 Parafilm 凹坑。

（4）将类器官居中定位

用 10 μL 吸头轻柔推动组织，使其位于类器官专用基质胶液滴中央。

（5）聚合类器官专用基质胶

将含 Parafilm 的 60 mm 培养皿放回 37°C 培养箱，孵育 20–30 分钟，使类器官专用基质胶完全聚合固化。

（6）配制全脑类器官分化完全培养基d。

向上步基质胶聚合固化好的超低吸附六孔板中加入2 mL全脑类器官分化完全培养基d。

（7）从 Parafilm 上回收类器官专用基质胶液滴

用无菌镊子夹住 Parafilm 薄膜，翻转过来，轻轻晃动培养皿，使类器官专用基质胶液滴自然脱落。若仍有液滴附着，可在培养基中更用力地抖动 Parafilm，促使其全部脱落。随后将含有组织的类器官专用基质胶液滴继续置于 CO₂ 培养箱中培养。

注意：每次最多处理 16 个类器官或更少，避免干燥或类器官专用基质胶提前凝固。

Day 12-14：

（8）包埋后24 h（D12）全量换液脑类器官分化培养基d，并继续培养至D14。

脑类器官成熟

Day 15-40+：

（1）配制全脑类器官分化完全培养基e。

（2）第15天，全部更换为3 mL脑类器官分化培养基e。置于轨道摇床，按照 80 rpm 转速持续振荡培养。

（3）每3-4 d完全更换一次全脑类器官分化完全培养基e。避免类器官过密，以防融合。

注意：在培养过程中定期在显微镜下监测类器官形态。在此期间脑类器官可显著增大，至D40天后逐渐展现类似大脑皮层的多层结构，类器官直径可达到mm级，此时肉眼观察可见白色聚集体。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human whole brain organoids were prepared from hPSCs with Plurioid^TM Human PSC-Derived Whole Brain Organoid Kit（HiWBO-K100，SHR Biotechnology, Wuxi, China) according to manufacturer instructions.

附录1 hPSC脑类器官构建流程

图1 制备带凹坑的 Parafilm 基底。

图2 hPSC脑类器官构建流程图。比例尺：200 μm。

图3 hPSC脑类器官免疫荧光染色鉴定。对D25（发育期）阶段和D50（成熟期）的脑类器官进行Tuj1和SOX2的检测。SOX2表征神经前体细胞，Tuj1表征早期神经元细胞。比例尺：50 μm。

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
hPSC完全培养基	SHR Biotechnology	HPCM-100
hPSC培养专用基质胶	CORNING	354277
hPSC传代消化液	SHR Biotechnology	HPPD-100
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