产品介绍

人肺泡类器官完全培养基是一款用于扩增和分化源自人肺泡上皮II型（ATII）细胞的肺泡类器官的商品化培养基，包括人肺泡类器官扩增培养基（HAvEM）和人肺泡类器官分化培养基（HAvDM）。HAvEM能够使ATII细胞作为类器官长期传代和扩增，这些肺泡类器官保留了ATII细胞表型的特性，包括自我更新的能力、标志物表达和分化为肺泡上皮I型（ATI）细胞的谱系潜力。HAvDM可在短时间内（10天左右）将扩增的ATII类器官分化为ATI类器官，这些肺泡类器官显示出ATII标志物表达降低和ATI细胞标志物的显著增加，非常适合肺泡生物学研究、传染病研究和药物筛选。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Human Alveolar Organoid Expansion Medium A	HAvCM-100	100 mL	4℃，6个月
Human Alveolar Organoid Expansion Medium B (50×)	HAvCM-100	1 mL × 2	-20℃，1年
Human Alveolar Organoid Expansion Medium C (250×)	HAvCM-100	0.4 mL	-20℃，1年
Human Alveolar Organoid Differentiation Medium A	HAvCM-100	20 mL	4℃，6个月
Human Alveolar Organoid Differentiation Medium B (50×)	HAvCM-100	0.4 mL	-20℃，1年
Human Alveolar Organoid Differentiation Medium C (200×)	HAvCM-100	0.1 mL	-20℃，1年

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
正常组织消化液	SHR Biotechnology	NTD-50
上皮类器官基础培养基	SHR Biotechnology	OBM-500
类器官传代消化液	SHR Biotechnology	OPD-100
类器官冻存液	SHR Biotechnology	OFM-50
类器官润洗液	SHR Biotechnology	OMR-100
类器官裂红液	SHR Biotechnology	OCM-50

人肺泡类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备人肺泡类器官完全培养基。以下是准备10 mL人肺泡类器官扩增培养基（HAvEM）和1 mL人肺泡类器官分化培养基（HAvDM）的示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 冰上解冻Human Alveolar Organoid Expansion Medium B (50×)、Human Alveolar Organoid Expansion Medium C (250×)、Human Alveolar Organoid Differentiation Medium B (50×)和Human Alveolar Organoid Differentiation Medium C (200×)。

注意：解冻后，建议将Human Alveolar Organoid Expansion Medium B (50×)、Human Alveolar Organoid Expansion Medium C (250×)、Human Alveolar Organoid Differentiation Medium B (50×)和Human Alveolar Organoid Differentiation Medium C (200×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于所有微量试剂组分，建议瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖分装使用，以避免损失。

2. 将200 μL Human Alveolar Organoid Expansion Medium B (50×)，40 μL Human Alveolar Organoid Expansion Medium C (250×)加至9.76 mL Human Alveolar Organoid Expansion Medium A中，充分混合，配制成10 mL人肺泡类器官扩增培养基（HAvEM）。

3. 将20 μL Human Alveolar Organoid Differentiation Medium B (50×)和5 μL Human Alveolar Organoid Differentiation Medium C (200×)加至975 μL Human Alveolar Organoid Differentiation Medium A中，充分混合，配制成1 mL人肺泡类器官分化培养基（HAvDM）。

注意：配制后的培养基可在2-8℃储存不超过7天，建议现配现用。Human Alveolar Organoid Expansion Medium A、Human Alveolar Organoid Differentiation Medium A内含有细菌及真菌抗生素。

人肺泡类器官原代培养

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关机构和政府法规。在收集人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

1. 将组织从4℃样本保存液（SPS-100）中取出，消化成单细胞悬液后，经流式或磁珠分选获得含有AT2细胞的EpCAM+肺上皮细胞群（或直接分选HTII-280+ AT2细胞群）。

2. 4℃ 300 g离心5 min，弃去上清保留沉淀。

3. 加入1 mL预冷的HAvEM培养基轻轻重悬沉淀，并进行活细胞计数，将细胞悬浮液调整至每25 μL 4000个细胞的浓度。

注意：如果需要，离心浓缩细胞沉淀后再以每25 μL 4000个活细胞的密度进行重悬。

4. 将准备好的细胞悬液按25 μL体积等分至无菌离心管中，每管加入25 μL基质胶（OEM-10），制成体积比大于50%的基质胶悬浮液，置于冰上。

5. 用1 mL移液器快速而轻柔地上下吹吸8-10次，形成均匀的悬浮液，避免气泡产生。将200 μL移液器设置为50 μL，小心吸取悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

6. 将铺好的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育35-50 min左右成胶。

7. 待基质胶完全凝固后，加入已配制好的HAvEM培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

8. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。每2~3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。扩增培养的人肺泡类器官生长状态如图1所示。

人肺泡类器官的传代培养

选取生长状态较好的肺泡类器官进行传代培养，步骤如下：

1. 在避免破坏基质胶的情况下，小心从待传代孔中吸出所有培养基，然后加入500 μL预冷的DPBS。

2. 用经过润洗液（OMR-100）润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

3. 用经过润洗液润洗的枪头反复吹打重悬类器官悬浮液20~30次，使得类器官与基质胶分离。

4. 4℃ 300 g离心5 min，弃上清，加入500 μL新的预冷DPBS，用经过润洗液润洗的枪头反复吹打重悬20~30次。

5. 4℃ 300 g离心5 min，弃上清，加入0.2 mL类器官传代消化液（OPD-100）重悬底部类器官沉淀，用经过润洗液润洗的枪头吹打后置于37℃下孵育，直到类器官消化完成。

注意：密切监测类器官消化情况，将消化时间控制在最短时间内完成（不要超过5 min）。根据经验，如果可以观察到类器官碎片小于30 μm，消化就完成了。

6. 4℃ 300 g离心5 min，吸弃上清液后，加入适量预冷的HAvEM培养基轻轻重悬沉淀，并进行类器官计数，调整至每25 μL 300个类器官的浓度。

注意：如果需要，离心浓缩类器官沉淀后再以每25 μL 300个类器官的密度进行重悬。

7. 每25 μL悬液加入25 μL基质胶（OEM-10），制成体积比大于50%的基质胶悬浮液。

8. 轻轻混匀后，小心吸取悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

9. 将铺好的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育35-50 min左右成胶。

10. 配制人肺泡类器官扩增培养基（HAvEM）。

11. 待基质胶完全凝固后，加入已配制好的HAvEM培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

12. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。每2~3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。传代培养的人肺泡类器官生长状态如图2所示。

人肺泡类器官的分化培养

在扩增培养的第10天（或直到第14天），扩增期类器官可以在终点测定中进行分化培养，步骤如下：

1. 配制人肺泡类器官分化培养基（HAvDM）。

2. 在避免破坏基质胶的情况下，小心从待分化孔中吸出所有培养基，然后加入500 μL已配制好的HAvDM培养基。

3. 每3~4天更换一次培养基，在培养至第10天即可完全分化为ATI细胞，并可用于标准测定或收获用于免疫染色或流式细胞术分析等。

人肺泡类器官的冻存

当类器官平均直径长至100-200 μm，增殖活性较好且结构透亮，边界清晰时，即可进行冻存。具体步骤如下：

1. 吸弃原培养液，加入4℃预冷的上皮类器官基础培养基（OBM-500），用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

2. 用经过润洗液（OMR-100）润洗的枪头反复吹打重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

注意：吹打力度需要控制，尽量保证类器官的完整性，以提高冻存后的复苏活性。

3. 在室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

4. 加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）洗涤沉淀一次，室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

5. 类器官沉淀中加入1 mL预冷的类器官冻存液（OFM-50），吹打混匀后立即移入冻存管中。

6. 程序降温及长期保存：

冻存方法（1）：将冻存管放入梯度降温冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

冻存方法（2）：4℃冰箱放置10 min，转移至-20℃放置30 min，转移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

注意：-80℃冻存建议不超过3个月，液氮冻存建议不超过1年。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human alveolar organoids were cultured with Human Alveolar Organoid Complete Medium（HAvCM-100，SHR Biotechnology, Wuxi, China）according to manufacturer's instructions.

附录1 人肺泡类器官培养过程图

图1 人肺泡类器官扩增培养过程示例

（A）利用磁珠分选获取HTII-280+ AT2细胞后，接种培养。在生长至第7天时可观察到实心球结构形成；（B）在生长至第14天时，类器官数量进一步增多，直径增大；（C）在生长至第21天时，类器官直径显著增加。比例尺：500 μm。

图2 人肺泡类器官传代培养过程示例

（A）经消化后的人肺泡类器官在传代培养至第0天时，由不规则团块逐渐形成新的3D细胞球；（B）在第7天时类器官生长为实心结构；（C）生长至第14天时，类器官数量进一步增多，直径增加。比例尺：500 μm。

附录2 人肺泡类器官染色鉴定图

图3 人肺泡类器官免疫荧光染色

分别收集增殖期（上）和分化期（下）人肺泡类器官进行免疫荧光染色。AQP5（绿光）是I型肺泡上皮标志物，SFTPC（红光）是II型肺泡上皮标记物，DAPI标记细胞核。比例尺：20 μm。