产品介绍

人结肠类器官完全培养基是一款用于建立和维持人体肠道成体干细胞来源结肠类器官的完全培养基。结肠上皮的自我更新是由位于隐窝中的干细胞及其祖细胞的增殖驱动的。人结肠类器官在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面显示出与结肠上皮的一致性，因此在人结肠发育和疾病研究中具有广阔的应用前景。人结肠类器官还可以通过结肠上皮的体外扩增应用于再生生物学中。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Human Colonic Organoid Complete Medium A	HCCM-100	100 mL	4℃，6个月
Human Colonic Organoid Complete Medium B (50×)	HCCM-100	1 mL × 2	-20℃，1年
Human Colonic Organoid Complete Medium C (250×)	HCCM-100	0.4 mL	-20℃，1年
Human Colonic Organoid Complete Medium D (100×)	HCCM-100	1 mL	-20℃，1年
EDTA（0.5M）PH 8.0	OET200	0.2 mL	15-30℃，5年

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
上皮类器官基础培养基	SHR Biotechnology	OBM-500
类器官传代消化液	SHR Biotechnology	OPD-100
类器官冻存液	SHR Biotechnology	OFM-50
类器官润洗液	SHR Biotechnology	OMR-100
类器官裂红液	SHR Biotechnology	OCM-50
DPBS（不含钙镁离子）	-	-

人结肠类器官完全培养基的制备

在无菌条件下配制人结肠类器官完全培养基。以下是准备10 mL完全培养基的示例，如所需量不同，可相应调整用量。

1. 冰上解冻Human Colonic Organoid Complete Medium B (50×)、Human Colonic Organoid Complete Medium C (250×)和Human Colonic Organoid Complete Medium D (100×)。

注意：解冻后，建议将Human Colonic Organoid Complete Medium B (50×)、Human Colonic Organoid Complete Medium C (250×)和Human Colonic Organoid Complete Medium D (100×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于微量试剂组分Human Colonic Organoid Complete Medium C (250×)和Human Colonic Organoid Complete Medium D (100×)，建议瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖分装使用，以避免损失。

2. 将200 μL Human Colonic Organoid Complete Medium B (50×)、40 μL Human Colonic Organoid Complete Medium C (250×)和100 μL Human Colonic Organoid Complete Medium D (100×)加到9.66 mL Human Colonic Organoid Complete Medium A中，充分混合，配制成10 mL人结肠类器官完全培养基。

注意：配制后的人结肠类器官完全培养基可在2-8℃储存不超过1周，建议现配现用。Human Colonic Organoid Complete Medium A内含有细菌及真菌抗生素。

人结肠类器官的原代培养

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关机构和政府法规。在收集人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

1. 将组织从4℃样本保存液（SPS-100）中取出，评估所获得的组织块是否由上皮细胞组成，是否含有脂肪或肌肉组织。如果含有脂肪或肌肉组织，需在解剖显微镜下使用手术剪刀或手术刀和钳子尽可能移除非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉组织，立即继续下一步。

2. 用上皮类器官基础培养基（OBM-500）或DPBS冲洗肠组织，直到上清液澄清。

3. 使用外科剪刀或手术刀在细胞培养皿中将组织切成小块，并转移至含有5 mmol/L（终浓度，需要将原液稀释100倍后使用）EDTA的预冷DPBS中消化，置于4℃孵育30 min。

4. 消化完成后，将组织碎片转移到新的含DPBS的培养皿中清洗，重复一次以去除EDTA。

5. 用5 mL移液管在含预冷的DPBS的培养皿或50 mL离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液进行100 μm滤网过滤。

6. 收集穿过滤网的组织悬液，300 g离心力4℃离心3 min。如果细胞沉淀为红色，吸弃上清液后，加入2 mL类器官裂红液（OCM-50）重悬沉淀，在室温下裂解红细胞30 s-1 min，然后300 g离心3 min。

注意：红细胞裂解的具体时间可以根据红色深浅进行判断，尽量去除红细胞。

7. 弃上清，使用1 mL DPBS重悬组织沉淀，取20 μL悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取含所需隐窝量的悬液，300 g离心力4℃离心3 min，弃上清。

8. 用适量的类器官专用基质胶（OEM-10，>70% vol/vol）重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10 μL基质胶悬液含200至600个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30 s以避免基质胶过早凝固。

注意：24孔板每孔推荐接种一个30 μL基质胶滴，可根据细胞计数结果确定需要接种的胶滴数量。混合过程中应尽量避免产生气泡，以免影响后续观察以及类器官生长。

9. 将悬液点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

10. 将铺好的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15 min左右成胶。

11. 配制人结肠类器官完全培养基。

12. 待基质胶完全凝固后，加入已配制好的人结肠类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

13. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。每3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。

14. 密切监测类器官的形成。理想情况下，人结肠类器官可以在初次接种后5-8天之间进行首次传代。原代培养的人结肠类器官生长例图如图1所示。

人结肠类器官的传代培养

当类器官直径长至100-200 μm左右时，即可进行传代培养，具体步骤如下：

1. 吸弃原培养液，加入4℃预冷的培养基，用经过润洗液（OMR-100）润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

3. 在室温或4℃条件下300 g离心3 min，弃上清，加入0.2 mL类器官传代消化液（OPD-100）重悬底部类器官沉淀，用经过润洗液润洗的枪头吹打后置于37℃下孵育，直到类器官消化完成。也可以采用机械吹打方式进行类器官传代消化，即在加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）重悬底部类器官沉淀后，小心地将类器官悬浮液上下吹打30次，靠着管底部移液产生的压力来破坏类器官。

注意：密切监测类器官消化情况，使用类器官传代消化液时需要将消化时间控制在最短时间内完成（不要超过5 min）。根据经验，如果可以观察到大部分小细胞团（由10-50个细胞组成）出现，消化就完成了。建议优先采用机械吹打方式进行类器官传代消化，对于无法吹散的类器官进一步使用类器官传代消化液进行消化。

4. 加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）洗涤沉淀一次，室温或4℃条件下300 g离心3 min。

5. 重复步骤4一次。

6. 吸弃上清液后，用适量的基质胶（OEM-10，>70% vol/vol）重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30 s以避免基质胶过早凝固。

注意：如类器官生长状态较好，传代比例推荐为1:3~1:5，根据消化获得的细胞团数量选择。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30 μL左右。

8. 将接种完成后的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15-25 min待基质胶凝固。

9. 配制人结肠类器官完全培养基。

10. 待基质胶完全凝固后，加入已配制好的人结肠类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

11. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。传代后的人结肠类器官生长例图如图2所示。

人结肠类器官的冻存

当类器官平均直径长至100-200 μm，增殖活性较好且结构透亮，边界清晰时，即可进行冻存。具体步骤如下：

1. 吸弃原培养液，加入4℃预冷的上皮类器官基础培养基（OBM-500），用经过类器官润洗液（OMR-100）润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

2. 用经过类器官润洗液（OMR-100）润洗的枪头反复吹打重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

注意：吹打力度需要控制，尽量保证类器官的完整性，以提高冻存后的复苏活性。

3. 在室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

4. 加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）洗涤沉淀一次，室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

5. 类器官沉淀中加入1 mL预冷的类器官冻存液（OFM-50），吹打混匀后立即移入冻存管中。

6. 程序降温及长期保存：

冻存方法（1）：将冻存管放入梯度降温冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

冻存方法（2）：4℃冰箱放置10 min，转移至-20℃放置30 min，转移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

注意：-80℃冻存建议不超过3个月，液氮冻存建议不超过1年。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human colonic organoids were cultured with Human Colonic Organoid Complete Medium（HCCM-100，SHR Biotechnology, Wuxi, China）according to manufacturer's instructions.

附录1 人结肠类器官培养过程例图

图1 人结肠类器官原代培养过程图

（A）人结肠类器官原代培养第0天，可看到明显的隐窝结构；（B）培养到第2天时，可观察到薄壁囊泡结构的类器官出现；（C）继续生长至第6天，类器官直径明显增大。比例尺：500 μm。

图2 人结肠类器官传代培养过程图

（A）人结肠类器官传代后第0天可看到较小囊泡结构；（B）生长至第2天，囊泡明显增大，腔体透明状，状态较好；（C）继续生长至第3天，类器官囊泡持续增大，可继续传代。比例尺：500 μm。

图3 人结肠类器官扩增与分化培养例图

（A）人结肠类器官扩增阶段示意图，该阶段类器官大多为薄壁囊泡状结构；（B）人结肠类器官分化阶段示意图，该阶段类器官囊泡壁增厚，并伴有出芽，腔体中心有凋亡细胞聚集。比例尺：500 μm。

附录2 人结肠类器官鉴定图

图4 人结肠类器官HE染色

由图可见人结肠组织（左）和类器官（右）内细胞的排布，细胞核、细胞质颜色以及核质比均近似，且结构相近，提示类器官和来源组织在组织形态上相似。比例尺：50 μm。

图5 人结肠类器官免疫荧光染色

分别收集增殖期（左）和分化期（右）人结肠类器官进行免疫荧光染色。E-cad（绿色）标记肠上皮细胞、Muc2（红色）标记杯状细胞、DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：50 μm。