产品介绍

小鼠肝类器官完全培养基是一款用于建立和维持源自成体干细胞的小鼠肝类器官的商品化培养基。胆管上皮的自我更新是由肝脏中干细胞及其祖细胞的增殖驱动的。小鼠肝类器官包含肝细胞、胆管细胞，因此在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面表现出胆管上皮的所有特征，在肝脏发育和疾病的研究中具有良好的应用前景。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Mouse Liver Organoid Complete Medium A	MLCM-100	100 mL	4℃，6个月
Mouse Liver Organoid Complete Medium B (50×)	MLCM-100	1 mL × 2	-20℃，1年
Mouse Liver Organoid Complete Medium C (250×)	MLCM-100	0.4 mL	-20℃，1年

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
正常组织消化液	SHR Biotechnology	NTD-50
上皮类器官基础培养基	SHR Biotechnology	OBM-500
类器官传代消化液	SHR Biotechnology	OPD-100
类器官冻存液	SHR Biotechnology	OFM-50
类器官润洗液	SHR Biotechnology	OMR-100
类器官裂红液	SHR Biotechnology	OCM-50
DPBS（不含钙镁离子）	-	-

小鼠肝类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备小鼠肝类器官完全培养基。以下是准备10 mL完全培养基的示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 冰上解冻Mouse Liver Organoid Complete Medium B (50×)和Mouse Liver Organoid Complete Medium C (250×)。

注意：解冻后，建议将Mouse Liver Organoid Complete Medium B (50×)和Mouse Liver Organoid Complete Medium C (250×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于微量试剂组分Mouse Liver Organoid Complete Medium C (250×)，建议瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖分装使用，以避免损失。

2. 将200 μL Mouse Liver Organoid Complete Medium B (50×)，40 μL Mouse Liver Organoid Complete Medium C (250×)加至9.76 mL Mouse Liver Organoid Complete Medium A中，充分混合，配制成10 mL小鼠肝类器官完全培养基。

注意：配制后的小鼠肝类器官完全培养基可在2-8℃储存不超过1周，建议现配现用。Mouse Liver Organoid Complete Medium A内含有细菌及真菌抗生素。

小鼠肝类器官原代培养

1. 准备若干培养皿，加入4℃预冷的含有抗生素的DPBS备用。

2. 取小鼠原代肝组织，置于培养皿中用DPBS冲洗2次。

3. 使用外科剪刀或手术刀将组织切成0.5-1 mm³的小碎块，放入5 mL离心管中。

4. 加入10 mL预热过的正常组织消化液（NTD-50），37℃消化15-30 min。

注意：密切监测消化过程，每10分钟通过剧烈摇晃或上下吸取混合物来混合试管中的内容物。当大多数组织碎片能够通过1 mL移液管尖端时，消化过程就可以完成。为了防止过度消化，也可以在显微镜下观察消化情况。

5. 加入10 mL（约3~5倍体积）上皮类器官基础培养基（OBM-500）来终止消化，并轻轻地上下晃动离心管。

6. 使用100 μm滤网过滤，收集滤液。

7. 在4℃下，300 g离心滤液3 min，弃上清。如果细胞沉淀为红色，吸弃上清液后，加入2 mL类器官裂红液（OCM-50）重悬沉淀，在室温下裂解红细胞30 s-1 min，然后300 g离心3 min。

注意：红细胞裂解的具体时间可以根据红色深浅进行判断，尽量去除红细胞。

8. 吸弃上清液后，加入10 mL的上皮类器官基础培养基（OBM-500）重悬沉淀，300 g离心3 min，弃上清。

9. 吸弃上清液后，加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）重悬沉淀，转移至1.5 mL EP管中，300 g离心3 min。

10. 吸弃上清液后，用适量的类器官专用基质胶（OEM-10，>70% vol/vol）重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每μL基质胶悬液含8-20个细胞团（约200-500个细胞），重悬后置于冰上，重悬时间不超过30 s以避免基质胶过早凝固。

注意：24孔板每孔推荐接种一个30 μL基质胶滴，可根据细胞计数结果确定需要接种的胶滴数量。混合过程中应尽量避免产生气泡，以免影响后续观察以及类器官生长。

11. 将悬液点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

12. 将铺好的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15-25 min左右成胶。

13. 配制小鼠肝类器官完全培养基。

14. 待基质胶完全凝固后，加入已配制好的小鼠肝类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

15. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。每3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。

16. 密切监测类器官的形成。理想情况下，小鼠肝类器官可以在初次接种后5~7天进行首次传代。原代培养的小鼠肝类器官生长过程如图1所示。

小鼠肝类器官传代培养

当类器官直径长至100-200 μm左右时，即可进行传代培养，具体步骤如下：

1. 用经过润洗液（OMR-100）润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力吹打重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

3. 在室温条件下300 g离心3 min，弃上清，加入0.2 mL类器官传代消化液（OPD-100）重悬底部类器官沉淀，用经过润洗液润洗的枪头吹打后置于37℃下孵育，直到类器官消化完成。也可以采用机械吹打方式进行类器官传代消化，即在加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）重悬底部类器官沉淀后，小心地将类器官悬浮液上下吹打30次，靠着管底部移液产生的压力来破坏类器官。

注意：密切监测类器官消化情况，使用类器官传代消化液时需要将消化时间控制在最短时间内完成（不要超过5 min）。根据经验，如果可以观察到大部分小细胞团（由10-50个细胞组成）出现，消化就完成了。建议优先采用机械吹打方式进行类器官传代消化，对于无法吹散的类器官进一步使用类器官传代消化液进行消化。

4. 加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）洗涤沉淀一次，室温条件下300 g离心3 min。

5. 重复步骤4一次。

6. 吸弃上清液后，用适量的基质胶（OEM-10，>70% vol/vol）重悬组织沉淀。

注意：如类器官生长状态较好，传代比例推荐为1:3~1:5，根据消化获得的细胞团数量选择。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30 μL左右。

8. 将接种完成后的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15-25 min左右成胶。

9. 待基质胶完全凝固后，加入配制好的小鼠肝类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

10. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。传代后的小鼠肝类器官生长过程如图1所示。

小鼠肝类器官的冻存

当类器官平均直径长至100-200 μm，增殖活性较好且结构透亮，边界清晰时，即可进行冻存。具体步骤如下：

1. 吸弃原培养液，加入4℃预冷的上皮类器官基础培养基（OBM-500），用经过类器官润洗液（OMR-100）润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

2. 用经过类器官润洗液（OMR-100）润洗的枪头反复吹打重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

注意：吹打力度需要控制，尽量保证类器官的完整性，以提高冻存后的复苏活性。

3. 在室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

4. 加入1 mL上皮类器官基础培养基（OBM-500）洗涤沉淀一次，室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

5. 类器官沉淀中加入1 mL预冷的类器官冻存液（OFM-50），吹打混匀后立即移入冻存管中。

6. 程序降温及长期保存：

冻存方法（1）：将冻存管放入梯度降温冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

冻存方法（2）：4℃冰箱放置10 min，转移至-20℃放置30 min，转移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

注意：-80℃冻存建议不超过3个月，液氮冻存建议不超过1年。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Mouse liver organoids were cultured with Mouse Liver Organoid Complete Medium（MLCM-100，SHR Biotechnology, Wuxi, China）according to manufacturer's instructions.

附录1 小鼠肝类器官培养过程图

图1 小鼠肝类器官培养过程图示例

（A-B）原代培养至第7天时，可见明显的囊泡结构，直径可达500 μm；（C-D）传代后第3天视野可见数量显著增加的囊泡类器官，直径约200 μm左右。比例尺：（A、C）500 μm，（B、D）200 μm。