产品介绍

结直肠癌类器官完全培养基是一款专用于人类结直肠癌类器官体外培养的商品化培养基，可有效扩增与维持患者来源结直肠癌类器官的体外生长。患者来源的结直肠癌类器官能够高度还原原始肿瘤的基因组特征、病理表型及异质性，可精准模拟体内肿瘤微环境与生物学行为，在结直肠癌发病机制研究、个体化药物筛选、药效评估及精准医疗实践中具有重要应用价值与广阔前景。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Colorectal Cancer Organoid Complete Medium A	CROM-P100	100 mL	4℃，6个月
Colorectal Cancer Organoid Complete Medium B (50×)	CROM-P100	1 mL × 2	-20℃，1年
Colorectal Cancer Organoid Complete Medium C (250×)	CROM-P100	0.4 mL	-20℃，1年
Colorectal Cancer Organoid Complete Medium D (100×)	CROM-P100	1 mL	-20℃，1年

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
样本保存液	SHR Biotechnology	SPS-100
肿瘤组织消化液	SHR Biotechnology	TTD-50
肿瘤类器官基础培养基	SHR Biotechnology	TBM-500
类器官传代消化液	SHR Biotechnology	OPD-100
类器官润洗液	SHR Biotechnology	OMR-100
类器官冻存液	SHR Biotechnology	OFM-50
类器官裂红液	SHR Biotechnology	OCM-50

结直肠癌类器官完全培养基的制备

在无菌条件下配制结直肠癌类器官完全培养基。以下是准备10 mL完全培养基的示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 冰上解冻Colorectal Cancer Organoid Complete Medium B (50×)、Colorectal Cancer Organoid Complete Medium C (250×)和Colorectal Cancer Organoid Complete Medium D (100×)。

注意：解冻后，建议将Colorectal Cancer Organoid Complete Medium B (50×)、Colorectal Cancer Organoid Complete Medium C (250×)和Colorectal Cancer Organoid Complete Medium D (100×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于微量试剂组分Colorectal Cancer Organoid Complete Medium C (250×)，建议瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖使用，以避免损失。

2. 将200 μL Colorectal Cancer Organoid Complete Medium B (50×)，40 μL Colorectal Cancer Organoid Complete Medium C (250×)，100 μL Colorectal Cancer Organoid Complete Medium D (100×)加至9.66 mL Colorectal Cancer Organoid Complete Medium A中，充分混合，配制成10 mL结直肠癌类器官完全培养基。

注意：配制好的结直肠癌类器官完全培养基可在2-8℃储存不超过1周，建议现配现用。Colorectal Cancer Organoid Complete Medium A内含有细菌及真菌抗生素。

结直肠癌类器官的原代培养

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

1. 将新收集的结直肠癌组织从4℃样本保存液（SPS-100）中取出，评估所获得的组织块是否由上皮细胞组成，是否含有脂肪或肌肉组织。如果含有脂肪或肌肉组织，需在解剖显微镜下使用手术剪刀或手术刀和钳子尽可能移除非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉组织，立即继续下一步。

2. 用肿瘤类器官基础培养基（TBM-500）冲洗组织，直到上清液澄清。

3. 使用外科剪刀或手术刀在细胞培养皿中将组织切成1-3 mm³碎片，放入15 mL离心管中。

4. 加入5倍体积预热过的肿瘤组织消化液（TTD-50），37℃消化20-30 min。

注意：密切监测消化过程，可配合剧烈摇晃或使用减去尖端的1 mL枪头上下吸取混合物来加快消化进程。为了防止过度消化，每5-10 min应在显微镜下观察是否出现细胞团，并及时终止消化。

5. 加入10 mL肿瘤类器官基础培养基（TBM-500）来终止消化，并轻轻地吹打或上下晃动离心管混匀。

6. 使用100 μm滤网过滤，收集滤液。

7. 在4℃下，300 g离心滤液3 min，弃上清。如果细胞沉淀为红色，吸弃上清液后，加入2 mL类器官裂红液（OCM-50）重悬沉淀，在室温下裂解红细胞1-2 min，然后在4℃下300 g离心3 min。

注意：红细胞裂解的具体时间可以根据红色深浅进行判断，尽量去除红细胞。

8. 吸弃上清液后，加入10 mL肿瘤类器官基础培养基（TBM-500）重悬沉淀，在4℃下，300 g离心3 min，弃上清。

9. 加入1 mL肿瘤类器官基础培养基（TBM-500）重悬沉淀，转移至1.5 mL EP管，在4℃下，300 g离心3 min。

10. 吸弃上清液后，用适量的类器官专用基质胶（OEM-10，>70% vol/vol）重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每μL基质胶悬液含8-20个细胞团（约200-500个细胞），重悬后置于冰上，重悬时间不超过30 s以避免基质胶过早凝固。

注意：24孔板每孔推荐接种一个30 μL基质胶滴，可根据细胞计数结果确定需要接种的胶滴数量。混合过程中应尽量避免产生气泡，以免影响后续观察以及类器官生长。

11. 将悬液点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

12. 将铺好的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15-25 min左右成胶。

13. 待基质胶完全凝固后，加入已配制的结直肠癌类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

14. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。每隔3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。

15. 密切监测类器官的形成。理想情况下，结直肠癌类器官可以在初次接种后5-8天之间进行首次传代。原代培养的结直肠癌类器官培养过程如图1所示。

结直肠癌类器官的传代培养

当大部分类器官直径长至100-200 μm时，即可进行传代培养，具体步骤如下：

1. 吸弃原培养液，加入4℃预冷的培养基，用经过润洗液（OMR-100）润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力吹打重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

3. 在室温条件下300 g离心3 min，弃上清，加入0.2 mL类器官传代消化液（OPD-100）重悬底部类器官沉淀，用经过润洗液润洗的枪头吹打后置于37℃下孵育，直到类器官消化完成。也可以采用机械吹打方式进行类器官传代消化，即在加入1 mL肿瘤类器官基础培养基（TBM-500）重悬底部类器官沉淀后，小心地将类器官悬浮液上下吹打30次，靠着管底部移液产生的压力来破坏类器官。

注意：密切监测类器官消化情况，使用类器官传代消化液进行消化时需要将消化时间控制在最短时间内完成（不要超过5 min）。根据经验，如果可以观察到小块细胞（由10-50个细胞组成）的混合物，消化就完成了。建议优先采用机械吹打方式进行类器官传代消化，对于无法吹散的类器官进一步使用类器官传代消化液进行消化。

4. 加入1 mL肿瘤类器官基础培养基（TBM-500）洗涤沉淀一次，室温条件下300 g离心3 min。

5. 重复步骤4一次。

6. 吸弃上清液后，用适量的基质胶（OEM-10，>70% vol/vol）重悬组织沉淀。

注意：传代比例建议为1:2-1:5，根据消化获得的细胞团数量选择。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30 μL左右。

8. 将接种完成后的培养板置于37℃ CO₂恒温培养箱中，孵育15-25 min左右成胶。

9. 待基质胶完全凝固后，加入37℃预热的结直肠癌类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。如基质胶穹顶结构较高，可加入600 μL保证浸没完全。

10. 将24孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养。传代后的结直肠癌类器官培养过程如图2所示。

结直肠癌类器官的冻存

当类器官平均直径长至100-200 μm，增殖活性较好且结构透亮，边界清晰时，即可进行冻存，具体步骤如下：

1. 吸弃原培养液，加入4℃预冷的肿瘤类器官基础培养基（TBM-500），用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗液润洗的1.5 mL EP管中。

2. 用经过润洗液（OMR-100）润洗的枪头反复吹打重悬类器官悬液，使得类器官与基质胶分离。

注意：吹打力度需要控制，尽量保证类器官的完整性，以提高冻存后的复苏活性。

3. 在室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

4. 加入1 mL肿瘤类器官基础培养基（TBM-500）洗涤沉淀一次，室温条件下300 g离心3 min，弃上清。

5. 类器官沉淀中加入1 mL预冷的类器官冻存液（OFM-50），吹打混匀后立即移入冻存管中。

6. 程序降温及长期保存：

冻存方法（1）：将冻存管放入梯度降温冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

冻存方法（2）：4℃冰箱放置10 min，转移至-20℃放置30 min，转移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

注意：-80℃冻存建议不超过3个月，液氮冻存建议不超过1年。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Colorectal cancer organoids were cultured with Colorectal Cancer Organoid Complete Medium（CROM-P100，SHR Biotechnology, Wuxi, China）according to manufacturer's instructions.

附录1 结直肠癌类器官培养过程图

图1 结直肠癌类器官原代培养生长过程示例

（A）在生长至第3天时，可观察到明显的3D细胞球；（B）继续生长至第6天，类器官体积逐渐增大，呈空泡囊状结构；（C）在生长至第9天时，直径可达到300 μm，部分类器官呈致密结构，并可见褶皱。比例尺：100 μm。

图2 结直肠癌类器官传代培养生长过程示例

（A）经消化传代后的结直肠癌类器官生长状态良好；（B）生长至第3天时体积明显增加，且形态不规则；（C）继续生长至第5天时，类器官直径可达300 μm。比例尺：100 μm。

图3 结直肠癌类器官复苏后生长过程示例

（A）经复苏培养后第1天的结直肠癌类器官活性开始恢复；（B）生长至第4天时体积明显增加，且形态不规则；（C）继续生长至第7天时，类器官直径可达200 μm。比例尺：200 μm。

附录2 结直肠癌类器官组织染色鉴定图

图4 结直肠癌组织和类器官HE染色

由图可见结直肠癌组织（A）和结直肠癌类器官（B）内细胞内核质比近似，且类器官中有中空的内腔，表现出一致的特异性聚集形态，说明类器官和来源组织在组织形态上相似。放大倍数：200×，比例尺：50 μm。

图5 结直肠癌组织和类器官的CEA（癌胚抗原）免疫组化染色

结果显示CEA在结直肠癌组织（A）和类器官（B）中均呈强阳性表达，说明结直肠癌组织和对应类器官在癌特异性标志物表达上的一致性。比例尺：20 μm。

图6 结直肠癌组织和类器官CDK2（肠特异性表达转录因子）的免疫组化染色

结果显示CDK2在结直肠癌组织（A）和类器官（B）中均高表达，说明结直肠癌组织和对应类器官在组织异性标志物表达上的一致性。比例尺：20 μm。

图7 结直肠癌类器官的免疫荧光染色

（A）CK7（腺癌标志物）和β-catenin（Wnt通路活化标志物）的免疫荧光染色。（B）E-cadherin（肠上皮细胞标志物）和Ki67（细胞增殖标志物）的免疫荧光染色。DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：20 μm。