产品介绍

Plurioid^TM hPSC内耳类器官试剂盒是一款无血清培养系统，通过精确调控hPSC分化路径，可在60天左右将人多能干细胞（hPSC）高效诱导分化为具有3D结构的耳囊泡样类器官，形成毛细胞、支持细胞及与之形成突触连接的感觉神经元的复合感觉上皮结构。本产品为内耳发育机制研究、听力相关疾病建模、药物筛选及再生疗法开发提供了高度仿生且可重复的体外实验平台。

本试剂盒规格为1 miniKit，预计可生成30个内耳类器官，需要操作人员具有hPSC培养经验，并对类器官具有一定了解。

产品信息

产品组成	货号	规格	储存条件及周期
Embryoid Body Induction formation Basic Medium	HiIEO-K100	8 mL	4℃，6个月
Supplement A (5×)	HiIEO-K100	2 mL	-20℃，1年
Supplement B (100×)	HiIEO-K100	50 μL	-20℃，1年
Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Induction Basic Medium	HiIEO-K100	25 mL	4℃，6个月
Supplement C (20×)	HiIEO-K100	0.5 mL	-20℃，1年
Supplement D (20×)	HiIEO-K100	0.5 mL	-20℃，1年
Supplement E (20×)	HiIEO-K100	50 μL	-20℃，1年
Supplement F (20×)	HiIEO-K100	50 μL	-20℃，1年
Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Differentiation Basic Medium	HiIEO-K100	65 mL	4℃，6个月
Supplement G (20×)	HiIEO-K100	1.7 mL×2	-20℃，1年
Supplement H (500×)	HiIEO-K100	100 μL	-20℃，1年

hPSC内耳类器官完全培养基的制备

在无菌条件下制备hPSC内耳类器官完全培养基。以下是准备拟胚体诱导培养基，内耳类器官诱导培养基A，内耳类器官诱导培养基B，内耳类器官诱导培养基C，内耳类器官诱导培养基D，内耳类器官分化培养基E，内耳类器官分化培养基F的示例，如所需量不同，请进行相应用量调整。

1. 冰上解冻Supplement A (5×)，Supplement B (100×)，Supplement C (20×)，Supplement D (20×)，Supplement E (20×)，Supplement F (20×)，Supplement G (20×)，Supplement H (500×)。

注意：解冻后，建议将Supplement A (5×)，Supplement B (100×)，Supplement C (20×)，Supplement D (20×)，Supplement E (20×)，Supplement F (20×)，Supplement G (20×)，Supplement H (500×)按需分装后保存取用，避免反复冻融。对于所有微量试剂组分建议解冻后瞬时离心5秒钟（500-2000 rpm）后，再开盖使用，以避免损失。

2. 拟胚体诱导培养基a：将200 μL Supplement A (5×)，10 μL Supplement B (100×)加至790 μL Embryoid Body Induction formation Basic Medium中，充分混合，配制成1 mL拟胚体诱导培养基a。

3. 拟胚体诱导培养基b：将200 μL Supplement A (5×)加至800 μL Embryoid Body Induction formation Basic Medium中，充分混合，配制成1 mL拟胚体诱导培养基b。

4. 内耳类器官诱导培养基c：将250 μL Supplement C (20×)加至4.75 mL Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Induction Basic Medium中，充分混合，配制成5 mL内耳类器官诱导培养基c。

5. 内耳类器官诱导培养基d：将250 μL Supplement D (20×)加至4.75 mL Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Induction Basic Medium中，充分混合，配制成5 mL内耳类器官诱导培养基d。

6. 内耳类器官诱导培养基e：将50 μL Supplement E (20×)加至0.95 mL Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Induction Basic Medium中，充分混合，配制成1 mL内耳类器官诱导培养基e。

7. 内耳类器官诱导培养基f：将50 μL Supplement F (20×)加至0.95 mL Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Induction Basic Medium中，充分混合，配制成1 mL内耳类器官诱导培养基f。

8. 内耳类器官分化培养基g：将250 μL Supplement G (20×)加至4.75 mL Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Differentiation Basic Medium中，充分混合，配制成5 mL内耳类器官分化培养基g。

9. 内耳类器官分化培养基h：将250 μL Supplement G (20×)，10 μL Supplement H (500×)加至4.74 mL Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Differentiation Basic Medium中，充分混合，配制成5 mL内耳类器官分化培养基h。

注意：配制后的培养基可在2-8 °C储存不超过3天，建议现配现用。Embryoid Body Induction formation Basic Medium，Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Induction Basic Medium和Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Differentiation Basic Medium内含有细菌及真菌抗生素。

hPSC内耳类器官的诱导培养

提前复苏hPSC，传代两代以后，即可使用不同阶段内耳类器官诱导培养基依次进行诱导培养，具体步骤如下：

1、拟胚体诱导（耗时2天）

Day -2：

（1）当 hPSC 的汇合度达到 75%-85%，吸去培养基，用 2 mL DPBS室温清洗一次。

（2）吸去上清，加入 0.5 mL 预热至室温的hPSC传代消化液，转移到 37 ℃ 5% CO₂ 细胞培养箱中孵育1 min左右。

注意：待克隆边缘细胞出现收缩即可终止消化。

（3）吸去上清，加入等体积的hPSC完全培养基，并使用P1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，经台盼蓝染色确定细胞活性并计数。

注意：台盼蓝染色活细胞比例在90%以上。

（4）300 g离心3 min收集细胞后，加入拟胚体诱导培养基a重悬细胞至浓度为5×10⁴个/mL，接种至96孔U底超低吸附板内（5000个细胞，100 μL/孔）。在水平孔板离心机内300 g离心5 min后细胞聚集成球状。之后将孔板转移到37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育24 h。

注意：建议接种至孔板中心的30个孔，周围孔补加DPBS，以减少蒸发。一个孔生成一个类器官。

Day -1：

（5）吸去旧培养基，每孔加入100 μL拟胚体诱导培养基b，在37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中继续孵育24 h。此时球体开始出现明显边界。

2、内耳谱系诱导

Day 0-3：

将所有球体吸出至5 mL EP管中（使用剪去针尖的P1000吸头），自然沉降，用PBS洗两遍，内耳类器官诱导培养基c清洗两遍，再用内耳类器官诱导培养基d洗一遍，最后按每孔100 μL的内耳类器官诱导培养基d，重新接入96孔板内（原先的超低吸附板，每孔可用PBS清洗一遍），培养4天。清洗过后，球体周围碎细胞减少。

注意：

将类器官只种在板子的中心孔，周围一圈补加200 μL DPBS，以减少中心孔的培养基蒸发；

可定期视情况补加一点培养基，以稳定细胞因子的浓度。

Day 4-7：

在每孔中加入25 μL内耳类器官诱导培养基e，继续培养4天。

注意：内部产生泡状结构。

Day 8：

在每孔中加入25 μL内耳类器官诱导培养基f，继续培养4天。

注意：1. 内部观察到耳泡结构；2. 视情况定期补加培养基，以稳定细胞因子的浓度。

3、内耳类器官分化及成熟

Day 12-14：

（1）配制新鲜的内耳类器官分化培养基g，以及额外添加1%类器官专用基质胶的内耳类器官分化培养基h。将每个类器官吸出至5 mL EP管内，自然沉降，用PBS洗两遍。使用内耳类器官分化培养基g继续清洗2遍后重新接种至96孔板内培养，之后使用内耳类器官分化培养基h（额外添加1%类器官专用基质胶）继续培养3天，100 μL/孔。

注意：此时可观察到耳泡向周围凸起。

Day 15-17：

（2）吸去孔板内培养基，加入新鲜配制的内耳类器官分化培养基h，继续培养3天。

Day 18-19：

（3）吸去孔板内培养基，加入新鲜配制的内耳类器官分化培养基g，继续培养2天。

Day 20-60：

（4）在此期间继续使用内耳类器官分化培养基g，每2-3天更换新鲜配制的内耳类器官分化培养基g。

注意：此阶段耳泡凸起更加明显。随着培养时间延长，耳泡呈现向心性生长模式，类器官整体形态趋于规整，表面更加光滑。

注意事项

1. 产品的分装、使用等操作需在无菌环境下进行。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅供科研使用，禁止用于人体。

论文发表规范引用参考

Human inner ear organoids were prepared from hPSCs with Plurioid^TM Human PSC-Derived Inner Ear Organoid Kit（HiIEO-K100，SHR Biotechnology, Wuxi, China) according to manufacturer instructions.

附录1 hPSC内耳类器官构建流程

图1 hPSC内耳类器官构建流程图。比例尺：200 μm。

附录2 hPSC内耳类器官鉴定图

图2 hPSC内耳类器官免疫荧光鉴定图。其中E-CAD为耳囊阶段标记物，ANXA4、MYO7A为毛细胞标记物，MAP2、PROX1为神经元标记物。第28天，类器官形成典型耳囊结构，并出现耳前体细胞群；第52天，进一步分化出毛细胞及与之突触连接的感觉神经元；第60天后，内耳类器官发育形成成熟的毛细胞、听觉神经元等。比例尺：100 μm。

其他需准备的试剂信息

试剂名称	厂家	货号
hPSC完全培养基	SHR Biotechnology	HPCM-100
hPSC传代消化液	SHR Biotechnology	HPPD-100
类器官专用基质胶	SHR Biotechnology	OEM-10
hPSC培养专用基质胶	CORNING	354277
DPBS（不含钙镁离子）	-	-